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壳寡糖与巨噬细胞结合特性的研究

2022-06-27 08:58:40

摘要:背景和目的 自1977年第壹届国际几丁质、壳聚糖专题学术研讨会在美国召开以来,有关几丁质和壳聚糖的研究和开发在国内外得到了广泛的重视。但由于几丁质和壳聚糖溶解性能差,大大限制了它们的应用。所以,由几丁质/壳聚糖降解制备水溶性的几丁寡糖(Oligochitin)和壳寡糖(Oligochitosan)成为几丁质/壳聚糖产品的开发和研究的一个重要方向。国内外许多学者在这方面进行了多年的研究工作,并已使低聚产品产业化。 近年来,随着研究的深入,壳寡糖已被发现有许多独特的生理活性和功能。


如:


(1)分子量较小,易溶于水,有良好的组织相容性。


(2)可提高巨噬细胞的吞噬功能,抑制肿瘤细胞的生长和转移。


(3)在人体肠道内活化增殖双歧杆菌、乳酸杆菌,调节肠道的微生物生态平衡。


(4)在体外微酸环境中具有较强的抑菌抗菌作用,并有显著的保湿、吸湿能力。


(5)可作为植物功能调节剂,刺激植物生长,增强植物对病虫害的防御能力等。壳寡糖具有多种功能已被人们所普遍认同,但其确切的作用机制却并不十分清楚。 


巨噬细胞(Macrophage)既是免疫细胞,又是辅佐免疫应答细胞,可通过吞噬、抗原呈递、分泌细胞因子、激活淋巴细胞和产生活性氧、NO等作用而行使抗感染、抗肿瘤、免疫应答和免疫调节作用,是机体免疫系统的重要组成部分。 


浙江大学硕士学位论文 本实验观察荧光标记壳寡糖在体外与小鼠腹腔巨噬细胞的结合情况,了 解巨噬细胞壳寡糖结合组分的糖结合特异性,并初步探讨壳寡糖与巨噬细胞 结合后的信号传导途径。通过本实验为进一步阐明壳寡糖对巨噬细胞的免疫 调节机理和分离巨噬细胞壳寡糖结合组分提供一定的实验依据,为壳寡糖抗 肿瘤药物和功能食品的开发提供理论依据。这对于浙江省海洋资源的开发利 用具有重要的意义。


以上实验内容在国内外的文献检索中未见类似研究报道。 


材料和方法 INIH小鼠腹腔巨噬细胞的制备:


1、由NIH小鼠的腹腔 冲洗液制备巨噬细胞。巨噬细胞浓度为 IXIO‘/ml。


2、丹磺酚盼标记壳寡糖: 160 mg壳寡糖溶于 lml水,2 mll%新鲜配制的丹磺酚姘,lml3%三氯乙 酸,将上述三种物质混合,于真空离心机中干燥。


3、丹磺酚肘标记的壳寡糖 与巨噬细胞的结合情况:实验组以3厂smLmolil丹磺酚姘标记的壳寡糖与巨噬 细胞共同培养1。二和24小时:以处理过的丹磺酚姘作为对照组。冲洗后于 荧光倒置显微镜下观察实验组和对照组巨噬细胞的荧光强弱差异。


4、D(+) -甘露糖、In。,ertase、日-葡聚糖对丹磺酚胁标记壳寡糖与巨噬细胞结合的影响 作用:实验组先用 D +)-甘露糖、Invertase或日-葡聚糖作用 20分钟,加 入375mmol;’l丹磺酚肘标记壳寡糖继续培养2 ’J\时;对照组加入3厂smrnol/l 丹磺酚盼标记壳寡糖,继续培养2小时。冲洗后在荧光倒置显微镜下观察实 验组和对照组巨噬细胞的荧光强弱差异。


5、2-氨基叮陡酮标记壳寡糖;取400 uls mmo川壳寡糖于 0.5 ml Eppendorf管,离心冷冻干燥,加 30ul 34 nunol/12- 氨基叶陡酮,100ul刀 mol/l 硼氢氰化钠,混匀,离心,置于 45 ℃水浴反 应5小时,取出,离心冷冻干燥。


6、2-氨基叮咳酮标记的壳寡糖与巨噬细胞 的结合情况:实验组以 0二55 mmol/12-氨基叶陡酮标记的壳寡糖与巨噬细胞 共同培养二分钟,5分钟,30分钟。另取处理过的2-氨基叮陡酮作为对照组。 冲洗后激光扫描共聚焦显微镜下观察实验组和对照组巨噬细胞的荧光强弱的 差异。


7、D(+).甘露糖对 2-氨基叮唆酮标记壳寡糖与巨噬细胞结合的影响 2 浙江大学硕士学位论文 作用:实验组先用 4mg/ml(+)-甘露糖作用 20分钟,加入 0二55 mmol/12- 氨基叮陡酮标记的壳寡糖继续培养30分钟;对照加入0.255。OI/12-氨基叮 陡酮标记的壳寡糖继续培养30分钟。冲洗后在激光扫描共聚焦显微镜下观 察实验组和对照组巨噬细胞的荧光强弱差异。结果采用t检验。


8、不同浓度 的壳寡糖对巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度的影响:巨噬细胞于 37oC、5%CO,’ 孵箱中培养24小时,冲洗后加入10 wtol/IFIOO-3/AM 100 ill,37℃避光孵 育40分钟。冲洗后后置于激光扫描共聚焦显微镜下,首先测定静息状态下的 巨噬细胞胞浆游离钙水平,之后立即加入 ling/ml或 10mg/ml壳寡糖,监测 不同浓度的壳寡糖对巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度的影响。


参考文献:

期刊 

[1]水溶性壳聚糖抗肿瘤作用的实验研究[J]. 王芳宇,何淑雅,李邦良,费树荣.  中国生化药物杂志. 2001(01)

[2]海洋寡糖工程药物——壳寡糖制备分离新工艺及其抗癌活性研究[J]. 杜昱光,张铭俊,张虎,白雪芳.  中国微生态学杂志. 2001(01)

[3]水溶性壳聚糖对小鼠免疫功能与移植性肿瘤的影响[J]. 刘艳如,余萍.  福建师范大学学报(自然科学版). 1999(04)

[4]灵芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞胞浆游离Ca2+浓度的影响[J]. 李明春,雷林生,梁东升,许自明,杨淑琴,孙莉莎.  中国药学杂志. 1999(12)


图书 

[1]几丁质与医学[M]. 上海科学技术出版社 , 侯春林,顾其胜主编, 2001

[2]第六生命要素[M]. 第二军医大学出版社 , 顾其胜,侯春林编著, 1999

[3]激光扫描共聚焦显微术[M]. 人民军医出版社 , 李楠等主编, 1997


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