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基于酪蛋白磷酸肽和壳寡糖的三种新型钙递送体系组装、评价及体内活性研究-甲壳素壳寡糖

2022-05-11 09:10:53

摘要:现有的各种膳食钙强化剂都存在溶解度和生物利用率受限等问题,开发载钙效率更高和促钙吸收效果更好的新型钙递送体系是解决上述问题的重要途径。已有研究尝试利用蛋白质和多糖等天然生物高聚物组装保护性载钙体系,在提高钙强化剂载钙能力的同时,以期控制其在机体内的钙释放速率。


本文利用壳寡糖(COS)和酪蛋白磷酸肽(CPP)等天然原料组装了三种新型钙递送体系。借助Caco-2细胞模型、小鼠低钙膳食模型以及micro-CT断层扫描成像技术、凝胶电泳、波谱学、显微镜观察等手段,系统考察了三种钙递送体系的理化特性、形貌结构特征和分子间作用力,以及在体内外实现可控的钙释放、促进钙吸收和调节肠道微生物菌群的能力。


主要研究结果如下: 

 

1、Amadori型和TGase型钙递送体系的制备

  

基于Maillard反应和TGase催化反应两种分子交联方法,利用CPP和COS之间的糖基化反应,构建了两种不同组装模式的钙递送体系。Maillard反应的蕞佳条件为:CPP与COS质量比为0.6:1,pH7.5,加热时间3h,加热温度95℃,其钙载量相较于CPP单体提高了43.2%。TGase催化反应佳条件为:CPP与COS质量比为1:1,温育时间2.5h,加酶量12.5U/g,其钙载量相较于CPP单体提高了59.3%。两种钙递送体系在制备过程中均具有较好的工艺操作性。  


2、Amadori型和TGase型钙递送体系的评价  


粒径和Zeta电位分析结果显示:利用两种糖基化反应制备的钙递送体系在微观尺寸上较CPP和COS单体均明显增大,但其溶液稳定性较CPP和COS单体并无明显变化。抑制磷酸钙结晶和胃肠道模拟消化等体外实验结果表明,两种钙递送体系均能有效抑制钙盐类的结晶沉淀,并可有效延长CPP-Ca在胃肠道环境中的降解时间。红外光谱分析结果显示,Amadori型COS-CPP由CPP的-NH2与COS乙酰基上的C=O形成Amadori连接;而TGase型COS-CPP则由CPP的谷氨酰胺残基作为酰基供体,COS中葡糖胺(GlcN)的-NH2作为酰基受体,形成共价键。原子力显微镜和扫描电镜分析图像显示,两种钙递送体系在微观结构上均为CPP-Ca提供了屏障保护作用。另外,细胞实验结果表明,两种钙递送体系均能促进Ca2+在Caco-2细胞中的跨膜转运和吸收。

  

3、Amadori型和TGase型钙递送体系的体内活性研究

  

利用低钙饲料小鼠模型研究上述两种钙递送体系体内促钙吸收活性,结果发现,小鼠持续饲喂Amadori型和TGase型钙递送聚合物8周后,其骨骼指标中大应力(Maximum stress)和骨干重指数(Bone weight index)相较于模型组显著升高(P<0.05),显示两种钙递送体系均能有效提高小鼠骨骼抵抗外力形变的能力和改善小鼠骨骼的矿化程度。从小鼠股骨骨小梁micro-CT断层扫描成像技术分析结果发现两种钙递送体系组的骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨表面积/骨量(BS/BV)和骨小梁模式因子(Tb.Pf)相较于模型组均显著降低(P<0.05),骨表面积密度(BS/TV)相较于模型组均显著提高(P<0.05),表明两种钙递送体系均可显著提高小鼠骨骼的抗疲劳能力、降低其发生骨质疏松的风险。两种钙递送体系均能较好地维持回肠绒毛的结构完整性和正常的结构形态。


另外,Amadori型和TGase型钙递送体系均能有效发挥益生元作用,调节宿主肠道内部微生物菌群的分布,促进小鼠盲肠内容物中双歧杆菌属(Bifidobacterium)和乳酸菌属(Lactobacillus)的生长繁殖,降低大肠杆菌属(Escherichia Coli)和产气荚膜梭菌(C. perfringens.)的相对丰度,还能促进丁酸等有益次级代谢产物的合成,维护肠道健康,且TGase型钙递送体系对大肠杆菌属和产气荚膜梭菌的抑制效果要优于Amadori型递送体系。  


4、COS/TPP离子交联型钙递送体系的制备、评价及体内缓释研究  


利用COS与三聚磷酸钠(TPP)之间的离子交联反应,成功组装了包载CPP-Ca的载钙递送微粒。载钙量分析和质构特性分析结果表明,COS/TPP交联型钙递送体系具有良好的抗形变能力,且在酸性环境中具有较高的稳定性,能满足在胃酸环境中缓慢崩解并释放Ca2+的要求。热力学稳定性分析和红外光谱分析结果表明,COS/TPP交联型钙递送体系的热稳定性较好,可作为合适的装载材料,且COS与TPP分子之间的交联位点是P-O键。通过荧光电镜和扫描电镜等手段从微观结构上观察到COS/TPP离子交联型网状结构中包埋了大量的CPP-Ca聚合物。通过体外模拟消化实验和短期大鼠钙吸收实验发现,COS/TPP交联型钙递送体系可有效延长CPP-Ca在消化液中的降解和释放时间,且可在大鼠消化道内实现持续稳定地钙释放,并促进Ca2+在小肠内的转运吸收。


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